Χτισμένο στη δεξιά μεριά του λιμανιού,ακριβώς δίπλα από την είσοδο, το κάστρο των Ιπποτών του τάγματος του Αγίου Ιωάννη, αποτελεί το επιβλητικότερο μνημείο της Ενετοκρατίας.
Διατηρείται σε πολύ καλή κατάσταση και αποτελεί κλασικό δείγμα επιβλητικής αμυντικής της εποχής του. Ονομάζεται και κάστρο της νεραντζιάς, εξαιτίας των πολλών νερατζιών που υπήρχαν στον περίβολο του.
Κτίστηκε τον 14ο αιώνα από τους Ιππότες του τάγματος των Ιωαννιτών πάνω στα θεμέλια των τειχών της αρχαίας πόλης. Από εκεί, οι Ενετοί μπορούσαν να ελέγχουν τα πλοία που περνούσαν, αφού είναι ακριβώς απέναντι από τα μικρασιατικά παράλια.
Στην αρχαιότητα το κάστρο βρισκόταν σε νησί που συνδεόταν με την ξηρά μέσω γέφυρας, η οποία σώζεται μέχρι σήμερα και είναι γνωστή ως η γέφυρα της οδού Φοινίκων.
Η Γέφυρα του Κάστρου όχι μόνο αποτελεί τη σύνδεση με την πόλη, αλλά και τη σύνδεση με τον Πλάτανο, ένα από τα γηραιότερα δέντρα του κόσμου, που κατά την παράδοση κάτω από τη σκιά του δίδασκε ο Ιπποκράτης ο Κώος, γνωστός ως ο Πατέρας της Ιατρικής.
Ο γνωστός πλάτανος του Ιπποκράτη βρίσκεται μπροστά στο Κάστρο των Ιπποτών, στο κέντρο της πόλης της Κω. Πρόκειται για δέντρο τεραστίων διαστάσεων, που πιστεύεται ότι φυτεύτηκε από τον ίδιο και κάτω από αυτόν δίδασκε και δεχόταν τους ασθενείς του. Η περίμετρός του είναι 12μ και θεωρείτε το μεγαλύτερο στην Ευρώπη. Σύμφωνα με την παράδοση εδώ δίδαξε και ο Απόστολος Παύλος. Κάθε καλοκαίρι γίνονται πολιτιστικά δρώμενα στο συγκεκριμένο σημείο.
Για να κατασκευαστεί το κάστρο, χρησιμοποιήθηκαν ντόπιοι λίθοι και υλικά από τα ερείπια της αρχαίας πόλης, όπως κίονες, μαρμάρινες επιγραφές και επιτύμβιες στήλες. Αποτελείται από δύο περιβόλους, που χωρίζονται μεταξύ τους από μια πλατιά τάφρο και επικοινωνούν μέσω μιας επικλινούς γέφυρας.
Μεταξύ του εσωτερικού και εξωτερικού περιβόλου βρισκόταν ένα ιπποτικό κτίσμα (αποθήκη) το οποίο σήμερα χρησιμοποιείται ως μουσείο αρχιτεκτονικών μελών της Κω. Ο εσωτερικός περίβολος έχει τέσσερις κυκλικούς πύργους στις γωνίες, ενώ ο εξωτερικός είναι μεγαλύτερος, με ογκώδεις προμαχώνες στις τέσσερις γωνίες, κανονιοθυρίδες και επάλξεις.
Στην οροφή των εισόδων διακρίνουμε μεγάλους γρανιτένιους κίονες που είναι τοποθετημένοι εγκάρσια και μάλλον προέρχονται από την παλαιοχριστιανική βασιλική του Λιμανιού.
Μετά την επικλινή γέφυρα που συνδέει τους δυο περιβόλους, τον εξωτερικό και τον εσωτερικό, αριστερά βρίσκεται το παλιότερο βεβαιωμένο κτίσμα του κάστρου, ένας κυκλικός πύργος με τα οικόσημα των μεγάλων Μαγίστρων της εποχής.
Στην βόρεια πλευρά, ανάμεσα στους δυο περιβόλους, το παλιό ιπποτικό κτίσμα που μάλλον χρησιμοποιούνταν ως αποθήκη και που αναστηλώθηκε κατά την διάρκεια της Ιταλοκρατίας (1912-1943), σήμερα χρησιμοποιείται ως Μουσείο Αρχιτεκτονικής της Κω. Είναι ελεύθερα επισκέψιμο και χρησιμεύει για πρόχειρη έκθεση πολλών γλυπτών, βωμών, επιγραφών και άλλων αρχιτεκτονικών μελών.
